MTT比色法檢測TNF的生物活性

【操作步驟】
（1）取對數生長期的L929細胞，用0.25%胰蛋白酶消化2-3min，然后洗滌細胞2次，以去除消化液及原生長培養液；
（2）用RPMI-1640培養液調L929細胞濃度為2×105/ml；
（3）將上述細胞懸液加至96孔培養板，100 ul/孔；
（4）置37℃，5% CO2培養箱中培養24h；
（5）吸去細胞培養上清液后，各孔分別加入倍比稀釋的標準品和待測樣品，100ul/孔，各設雙復孔，并設培養液陰性對照及空白對照（即L929細胞、標準品及待測樣品均不加入，僅加培養液）；
（6）同時向各孔均加入10ul放線菌素D（0.5～1μg/孔）；
（7）置37℃，5% CO2培養箱中培養12-14h；
（1） 直接于每孔中加入MTT溶液，10μl/孔 ，37℃孵育4h；
（2） 從每孔中輕輕吸出培養上清液100μl/孔 ，棄去 ，再于每孔中加入酸化異丙醇或DMSO，100μl/孔，混勻，置室溫10min；
（3） 用酶標儀以檢測波長570nm，參考波長630nm分別測各孔OD值。
【結果分析】
（1） 取雙復孔平均值，各孔OD值為OD570nm-OD630nm，再減去空白對照OD值。
（2） 根據各孔OD值，分別計算出各稀釋度的標準品和待測樣品對應的L929細胞死亡率?？砂聪率接嬎悖?br /> 各孔細胞死亡率 = 陰性對照孔OD-含TNF孔OD × 100% 
陰性對照孔OD

（3）以Log2[稀釋度]為橫座標（X），以細胞死亡率（%）為縱座標（Y），分別繪制標準曲線和待測樣品曲線，根據導致50%細胞死亡的標準品和待測樣品曲線，根據導致50%細胞死亡的標準品和待測樣品稀釋度，按下式計算樣本TNF的活性單位：
TNF的活性單位
（U/ml） = 標準品導致50%細胞死亡的待測樣品稀釋度 × 標準品活性單位
（U/ml） 
導致50%細胞死亡的標準品稀釋度

（4）亦可根據正態概率紙法和概率單位法求得待測樣品TNF活性單位，可參見IL-1、IL-2的生物活性檢測部分及醫學統計學的有關內容。
【注意事項】
（1） L929細胞要充分洗滌，以去除原培養液，同時應均勻分布于各孔中，以免影響檢測結果。
（2） L929細胞不宜生長過密，只要孔內長成單層即可使用。
（3） L929細胞存活率應＞95%。
（4） L929細胞隨著傳代或受其他因素影響，對放線菌素D的敏感性會有差異，應先作預試驗確定其使用濃度。
（5） 倍比稀釋TNF標準品和待測樣品時，應以1:2開始至少6個稀釋度。
（6） MTT染色，其著色深淺不但與細胞數有關，還與細胞激活有關。如某種因素激活細胞后，其代謝率將增強，線粒體琥珀酸脫氫酶活性亦增強，著色也將加深。因此MTT染色時，應考慮待測樣品中是否含有能激活靶細胞的因素存在。
（7） 加入酸化異丙醇后，應在1h內測定各孔OD值。
（8） 本法亦可適用于待測細胞mTNF的檢測。